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激光扫描体视显微镜收集的注意事项

激光扫描体视显微镜关于要调查的区域,应先用明视场显微镜和一般荧光显微镜进行定位,当然也可运用共聚集体系的体视显微镜进行定位。但关于大多数初学者或非专业研究人员来说,在只运用共聚焦形式的情况下,常很难找到适宜的焦平面。所以应当学会运用共聚集体系装备的显微镜,以惯例形式预调查样品,由于要在一张富含数百个胚胎的标本中找出特定发育期间的某种基因的表达十分艰难,如直接选用共聚集形式扫描标本,常很费时。很多仪器具有疾速扫描功用,可在必定程度上补偿这种缺点,但在快扫形式下,其分辨率低。因而,当寻找罕见的现象时,较简单的方法是运用一般形式调查切片,一旦发现立刻切换到共聚集形式进行图画收集。

成功进行共聚集图画收集的关键是掌握透镜NA,针孔巨细和图画亮度之间的互相配合,关于亮度,应以可取得最佳图画的最小激光强度为规范,即在确保成像的情况下,激光功率应尽也许小。可运用软件的扩大功用扩大图画,并将所得的图画与高NA物镜所得的图画进行对比。在体视显微镜特定成像参数的设定操作时,应在标本要调查的特定区域以外进行,防止有价值的区域发作光漂白。常包含设定PMT探测器的增益和背底水平,以及何时的针孔巨细,确保在可接受的分辨率和足够的反差之间取得平衡,运用最低的激光功率以防止发作过多的光漂白。很多仪器具有颜色表,有助于设定图画中的准确动态规模。在8比特系统中,该表将最黑的像素设定为0.为伪彩绿色,而最亮的像素设定为255,为伪赤色。增益和背底水平以及针孔的调理,使其改变规模在0-255之间,这种调理也可通过肉眼进行。但在进行实践图画收集时,标本的荧光不均匀,也许超出规模,因而,亮的区域也许隐瞒暗的区域。

收集的图画常储存在计算机的硬盘中,然后再进行仿制。通常在图画收集过程中,应收集尽也很多的图画,假如需求删去,可在随后的图画处理过程中删去不满意的图画。有时开端看似不满意的图画,在日后的进一步复审中也许变得价值特殊,因而,在进行图画删去时,应慎之又慎!要与曾经制备标本时各项条件保持一致,再仿制制备标本十分磨难,有时是不也许的。

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